Методы как инструменты изучения бактерий их основных свойств

Для обывателя, не посвященного в таинства микробиологических исследований, весь процесс изучения микробов представляется сложным, специфическим и требовательным к качеству и количеству специального оборудования. Такое представление соответствует действительности только отчасти, поскольку вся сложность и специфичность построена на определенной микробиологической азбуке. Эта азбука состоит из описания методов изучения бактерий и других микроорганизмов, а также из порядка построения выводов по результатам проведенных исследований.

Общие положения

К общим положениям при изучении методов исследования микробов можно отнести порядок выбора того инструмента, которым будут производиться лабораторные анализы бактериальной клетки, и последовательность интерпретации тех выводов, на основании которых будут фиксироваться окончательные заключения по изучаемому микроорганизму.

Выбор метода изучения в первую очередь зависит от предмета исследований:

1. Если планируется изучить строение и морфологию клетки, ее ультраструктуру (составные структуры и компоненты) и установить наличие подвижности, используется два вида микроскопии: микроскопия бактериальных клеток в живом состоянии и в окрашенном виде.
2. Изучение метаболизма и ферментативной активности микроорганизмов производится путем посева выращенных колоний на дифференциально-диагностические питательные среды.
3. Определение чувствительности к антибиотикам производится методом диффузии в агар.
4. Изучение генетики микроорганизмов (их наследственности и изменчивости) осуществляется путем проведения перераспределительного теста, методом реплик и ряда других специализированных исследований.

Каждый из указанных методов имеет свои вариации исполнения, которые зависят от особенностей условия проведения анализа и от изучаемого материала.

Кроме того, есть масса узкоспециальных микробиологических экспериментов, которые позволяют определить те или иные особенности структуры или свойств бактериальной клетки.

Изучение морфологии и подвижности

Морфологическое исследование в основном направлено на идентификацию бактерий.

Изучение форм и выявление подвижности проводится методом микроскопирования живых бактерий.

Основные структуры микроорганизма анализируются в препаратах раздавленной или висячей капли. Это способ нанесения бульонного раствора с бактериальной культурой на предметное стекло.

Этот метод определения строения бактерии может проводиться путем наблюдений в «темном поле зрения».

Принцип эксперимента заключается в том, что исследователем создаются такие условия, когда микробные тела не освещаются напрямую, а отражают лучи света, что позволяет рассмотреть их основные структуры более подробно и в нативной (естественной) среде.

Анализ с использованием различных способов окрашивания предполагает, что окрашиваться будут убитые микробные клетки, поскольку они лучше окрашиваются.

Для проведения анализа необходимо осуществить несколько манипуляций:

1. Приготовить мазок исследуемого материала. В эту стадию входит работа с исследуемым материалом (кровь, мокрота и т.д.).
2. Высушивание и фиксация мазка химическим или физическим способом.
3. Выбор вида окрашивания (сложный или простой).

Простым способом бактериальные клетки окрашивают в большинстве случаев только для того, чтобы выявить в исследуемом материале присутствие микроорганизмов. Этот способ представляет собой окрашивание мазка метиленовым синим. Данный краситель окрашивает фон мазка на порядок слабее, чем клетки самих микроорганизмов.

Обнаружение основных структур бактериальной клетки осуществляется с использованием сложного окрашивания:

• метод Грама (определение свойств клеточной стенки);
• окраска на выявление спор;
• окраска по Романовскому-Гимзе окрашивает в разные цвета основные структуры клетки;
• выявление капсул по способу Гинса;
• выявление зерен волютина (внутриплазматические гранулы, состоящие из неорганических полифосфатов), их присутствие указывает на наличие возбудителя дифтерии.

Исследование ферментативной активности и метаболизма

Исследование ферментативной активности и метаболизма бактериальных клеток начинается с подбора питательных сред, на которых изучаемые микроорганизмы смогут проявить нужные исследователю свойства.

Для приготовления питательных сред используются:

• продукты животного происхождения;
• продукты растительного происхождения;
• органические и неорганические соединения определенного химического состава.

По своему составу питательная среда должна быть:

• с подходящим для конкретного вида микроорганизмов уровнем рН (кислотностью);
• с достаточным уровнем влажности, поскольку для бактерий важно состояние осмотического давления внешней среды;
• изотоничной и стерильной.

После создания питательной среды осуществляется посев на нее биологического материала и выделение чистой культуры.

После выделения и идентификации чистой культуры изучаются ее биохимические свойства и ферментативная активность.

Для определения ферментативной активности бактериальной клетки выделенную культуру засевают на дифференциально-диагностические питательные среды, которые заранее созданы под выявление того или иного фермента.

1. Для обнаружения сахаролитической биохимической активности клетки исследуемой культуры засевают в пять пробирок, в которые закладывают разные органические сахара. В зависимости от того, в какой из пробирок будет выявлена биохимическая активность (сработает цветовой индикатор), определяется, какими сахаролитическими свойствами обладает исследуемая бактериальная клетка.
2. Для определения протеолитической активности чистую бактериальную культуру засевают на мясопептонный желатин. Там, где под действием протеолитического фермента происходит расщепление белков желатина (разжижение), там и фиксируется присутствие протеолитического фермента. Для определения глубины работы протеолитических ферментов при данных анализах проводят исследование на выявление индола и сероводорода (конечных продуктов протеолитического распада).
3. Установление редуцирующей способности бактерий производится с засеванием лакмусового молока. Присутствие редуктазы проявляется специфическим обесцвечиванием молока.
4. Выявление каталазы происходит путем фиксации на плотной питательной среде в чашке Петри появления пузырьков газа, который выделяется в результате расщепления перекиси водорода под действием каталазы.

Данные исследования позволяют определить основные свойства тех или иных микробов. Так, присутствие протеолитического или сахаролитического фермента – свидетельство наличия патогенных для человека, животных и растений свойств изучаемого микроорганизма.

Исследование чувствительности к антибиотикам

Исследование чувствительности микроорганизмов к антибиотикам осуществляется по принципу деления бактерий на чувствительных и устойчивых к воздействию антибиотиков.

Изучение этого свойства особенно важно для практической медицины, где постоянно необходимо исследовать инфицированный материал и подбирать антибиотики для лечения.

Ввиду того что микробы умеют быстро приспосабливаться к тому разрушающему воздействию, которое на них оказывают антибиотики, очень важно на начальных стадиях лечения определить, как будет воздействовать запланированный к лечению антибиотик и присутствует ли у исследуемого биологического материала чувствительность к планируемому способу антибактериального воздействия.

1. Для начала при помощи исследований патогенного материала определяют, какой микроб ведущий в очаге заражения (определение ведется, в том числе, и методом количественного подсчета).
2. Если установлен ведущий микроорганизм, то его чувствительность определяется путем диффузии в агар с применением бумажных дисков. Специально разработанные и выпускаемые бумажные диски заранее обработаны антибиотиками в нужной концентрации. Чувствительность к определенному антибиотику на бумажном диске определяется по замедленному росту колонии на соответствующих зонах диска и по разному окрашиванию дисков.

Кроме метода с использованием бумажных дисков, также для определения чувствительности бактерий к антибиотикам применяется способ стерильных разведений. Бульонные культуры микробов вносят в разведенные растворы антибиотиков. В процессе изучения микробов на чувствительность к антибиотикам пробирки инкубируют и выдерживают определенное количество времени.

Результаты исследования изучают по таблице чувствительности, где указаны исходные и конечные данные концентрации антибиотиков и биологического материала.

Исследование генетики бактерий

Генетика позволяет определить свойства наследственности и изменчивости конкретного микроорганизма. Изучение этих свойств очень важно, поскольку дает возможность понять механизм тех мутаций в генном коде, которые позволяют бактериям с такой невероятной скоростью и легкостью приспосабливаться к изменяющимся внешним условиям.

Еще одной важной особенностью генетики бактерий является то, что ее принципы справедливы для всего органического мира. Изучив генетику бактерий, можно на молекулярном уровне установить все основные эволюционные законы.

Основной предмет изучения генетики бактерий – мутации (скачкообразное изменение наследственного признака).

Исследование мутаций происходит с использованием бактериофагов (вирусы бактерий, которые разрушают бактериальную клетку).

Вырабатываемая бактериями в результате мутаций устойчивость к фагам фиксируется разными методами:

• флуктуационный тест;
• перераспределительный тест;
• метод реплик и т.д.

Изменение в генетике исследуемой бактерии фиксируется только тогда, когда приобретенной одной колонией свойство передается по наследству следующим поколениям.

Мутантов среди бактерий выявляют следующими методами:

• прямой отбор (посев на специально подобранную селективную среду);
• непрямое выявление, так называемый метод перепечатывания колоний с одной чашки Петри на другую до обнаружения прогнозированных мутантов;
• пенициллиновый метод позволяет достаточно быстро выявить мутантов, поскольку вводимый исследователем пенициллин угнетает рост немутировавших клеток.

Исследование генетики бактерий производится с использованием новейшего оборудования, которое позволяет не только выявить изменения наследственности, но и на молекулярном уровне определить их природу.

Сегодня такие исследования генетики бактерий находятся в активной фазе. Микробиологи регулярно делятся зафиксированными новинками. О завершении исследований в этой области говорить пока еще очень рано.

Светлана

Образование высшее филологическое. В копирайтинге с 2012 г., также занимаюсь редактированием/размещением статей. Увлечения — психология и кулинария.