Изучение микроорганизмов под микроскопом требует специальной подготовки образца, ведь в естественном состоянии бактерии практически прозрачны и невидимы. Для их окрашивания разработаны методики, позволяющие не только определять морфологические свойства, но и их видовую принадлежность. Тинкториальные свойства бактерий отражают способность микробов воспринимать красители и имеют важное практическое значение для определения возбудителя инфекционных заболеваний.
Задачи, решаемые методами окрашивания
Методы окраски микробов широко применяются в бактериологии. Благодаря тинкториальным свойствам, характерным для микроорганизмов, появляется возможность определять форму, строение, размер, взаиморасположение и локализацию бактерий.
Окрашивание микробов является одной их техник микробиологии, позволяющих исследовать не только внешнее, но и внутреннее строение организмов. Это возможно благодаря свойству различных частей бактерии по-разному взаимодействовать с красителями, то есть тинкториальным свойствам микроорганизмов.
Подготовка и окраска образца
Независимо от практикуемой методики окрашивания, существуют определенные стадии, обязательные к выполнению:
- приготовление образца – на предметное стекло в каплю воды бактериологической петлей вносят материал, подлежащий изучению;
- сушка мазка проводится при комнатной температуре либо в потоках теплого воздуха (удаленно от источника тепла);
- фиксация – способ прикрепления микроорганизмов к стеклу для усиления восприимчивости к краске;
- окраска – образец покрывают красителем, выдерживают определенный временной интервал, после чего краситель удаляют и промывают образец водой;
- сушка – заключительная стадия приготовления образца для изучения.
Наиболее типичные красители
Для получения окрашенного образца используют анилиновые красители с различным значением рН.
- Основные (ударение на второе О) красители – красящим агентом является катион. Использование определенных реагентов позволяет окрашивать микробы в разные цвета:
- красный – нейтральрот, фуксин основной, сафранин, пиронин;
- фиолетовые – генциан-, метил- и кристаллвиолет, тионин;
- синий – виктория и метиленовая синь;
- зеленый – метиленовая и малахитовая зелень;
- коричневый – хризоидин и везувин;
- черный – индулин.
- Кислые (рН меньше 7) красители – красящими свойствами обладает анион. Наиболее распространенными красителями микробов являются:
- красный – эозин и кислый фуксин;
- желтый – пикриновая кислота;
- черный – нигрозин.
- Нейтральные краски – окрашивают как катионы, так и анионы; примером является родамин В.
Способы окрашивания
Существующие методы окраски, учитывающие тинкториальные свойства, которые применяет микробиология, можно разделить на три основных типа.
Витальный способ
Витальное, или прижизненное, окрашивание является методическим решением вопроса микроскопирования живых тканей. Введение красителей позволяет, благодаря тинкториальным свойствам, различать внутриклеточные структуры, а также наблюдать процессы функционирования живых организмов.
Существует методика витального окрашивания, когда изучаемый организм после окраски умерщвляется.
Для прижизненного окрашивания, с учетом тинкториальных свойств, используются специальные красители, отличительными особенностями которых считается:
- низкая токсичность препаратов;
- высокая проникающая способность красителей.
Помимо витальных красителей для оптических наблюдений, учитывающих тинкториальные особенности, существуют красители флуоресцентные, которые называют флуорохромами.
Поствитальный способ
В отличие от витального, окрашивание производят после фиксации (умерщвления) микробов. Поствитальное окрашивание, с учетом тинкториальных особенностей, подразделяют на простые и сложные методы окраски, которые различаются по поставленным задачам:
- простые, благодаря тинкториальным свойствам, определяют морфологические признаки: величину, форму, локализацию, взаиморасположение бактерий;
- сложные методы являются узконаправленными, но они позволяют получить видимую картину структуры микроорганизма.
Сложные способы окрашивания, учитывающие тинкториальные свойства микробов, чаще всего носят имена своих разработчиков. Наиболее употребимыми являются следующие сложные окраски.
Методика Грама
Разработанный в конце 19 века способ дифференциации микроорганизмов по проницаемости клеточных стенок. Посредством обработки микробов анилиновыми красителями – метиловым или генциановым фиолетовым и промывки образца образуются две группы:
- характерная синяя окраска – грамположительные микроорганизмы;
- обесцвеченные промывкой – грамотрицательные.
Для получения полной картины, учитывая тинкториальные свойства исследуемых микробов, используется красный краситель, после чего все грамотрицательные микроорганизмы приобретают цвет от розового до красного.
Тест Грама классифицирует микроорганизмы и позволяет провести разделение микроорганизмов, благодаря тинкториальным свойствам, по критерию строения стенки клетки. Прикладное значение методики окраски по Граму – диагностика различных инфекционных заболеваний.
Методика Циля-Нельсена
Методика появилась в конце 19 века,она позволяет определить кислотоустойчивость бактерий методами окраски. Таким образом, благодаря тинкториальным свойствам микроорганизмов, выявляются возбудители лепры, туберкулеза, микобактериоза.
Метод Романовского-Гимзе
Предложена была эта методика в начале 20 века. В результате окрашивания специальным красителем образцы ацидофильных бактерий окрашиваются в разные оттенки красного, а базофильные – начиная пурпурным и заканчивая синим.
К ацидофилам относятся уксуснокислые и молочнокислые бактерии, которым для жизни требуется значительно более низкое показание кислотности среды.
Базофилами называют бактерий, способных окрашиваться основными красителями. Метод подразделяет микробов по значению рН среды. Он опирается на тинкториальные свойства микробов и нашел широкое применение при изучении морфологии спирохет и простейших.
Метод Бурри-Гинса
Разработка позволяет обнаружить наличие капсул у бактерий.
Метод Морозова
Способ окраски позволяет сделать видимыми жгутики бактерии. Для этого следует провести следующие действия:
- первичная обработка образца кислотой (жгутики разрыхляются);
- фиксация разрыхленных тканей танином;
- окрашивание азотнокислым серебром.
Видимыми становятся сама бактерия и все ее жгутики. Они приобретают цвета от желтого до коричневого.
Окрашивание спор бактерий
Тинкториальные свойства бактерии позволяют путем окраски сделать видимыми ее споры. Для этого можно применить метод Циля-Нильсена: обработка образца фуксином Циля и дальнейшее обесцвечивание 1% серной кислотой. Споры бактерий, окрашенные в розовый цвет, хорошо просматриваются на фоне синих бактерий.
Другой метод получения видимой картины спор – метод Ожешко. Оболочки спор протравливают кислотой при высокой температуре, далее применяется окраска по Цилю-Нельсену.
Технология окрашивания
Основная часть красителей – сухие вещества в виде порошка. Первый шаг приготовления – спиртовые концентраты из порошка, которые в дальнейшем используют для приготовления водоразбавленных растворов.
Именно ими окрашивают бактериальные клетки, наливая раствор на мазок с определенной временной выдержкой. Впоследствии мазок промывают водой до бесцветности воды и сушат.
Препарат готов к работе. Благодаря тинкториальным свойствам бактерий неравномерно окрашиваться, при микроскопировании можно увидеть не только границы бактериальной клетки, но и ее строение.
Работаю врачом ветеринарной медицины. Увлекаюсь бальными танцами, спортом и йогой. В приоритет ставлю личностное развитие и освоение духовных практик. Любимые темы: ветеринария, биология, строительство, ремонт, путешествия. Табу: юриспруденция, политика, IT-технологии и компьютерные игры.
Загрузка...
