Основные методы лабораторного выявления бактерий

Метод изучения – определенная совокупность действий, которая позволяет исследователю достичь цели исследования. Основой для бактериологических изысканий являются методы общей микробиологии. Именно на них основан метод выявления бактерий рода Salmonella и других опасных для человека микробов, а также обнаружение прокариотов в окружающей среде для других утилитарных целей.

Где и зачем искать?

Проверять пищу человека на содержание в ней разных видов микроорганизмов – общеизвестная задача микробиологических исследований на выявление штаммов бактерий с разной степенью вирулентности.

Однако ввиду стремительного развития биотехнологий, необходимость выявлять определенные виды микроорганизмов может возникать в самых разных отраслях жизнедеятельности человека:

• медицина и ветеринария;
• фармацевтика;
• пищевая промышленность;
• сельское хозяйство и переработка сельскохозяйственных продуктов;
• химическая промышленность.

Кроме того, выявление прокариотов с целью их изучения – одна из самых актуальных задач микробиологов, которые сегодня только начинают знакомиться с огромным разнообразием представителей безъядерной органики.

При работе с тем или иным биологическим материалом в микробиологических лабораториях используются несколько основных методов:

• микроскопия (световая, электронная);
• биологические методы (культивирование и идентификация организмов);
• молекулярно-генетический метод;
• серологический (выявление антигенов).

Эти основные методы позволяют не только обнаружить не видимые невооруженным глазом бактериальные клетки, а и изучить их структурные элементы и фазы жизнедеятельности.

Данные о структуре и жизненных процессах изучаемых бактерий позволяют идентифицировать выделенный биологический материал и соотнести его с теми видами прокариотов, которые уже описаны в микробиологической литературе или же зарегистрировать открытие новых видов безъядерных организмов.

Оборудование микробиологической лаборатории

Возможность применять методы выявления клеток бактерий может присутствовать только в рамках организации бактериологической лаборатории. Это специально оборудованные комплексы, которые функционируют:

• при поликлиниках и диспансерах;
• при санитарно-эпидемиологических станциях или их подразделениях;
• при научно-исследовательских центрах;
• при предприятиях по выпуску биопрепаратов.

Практически все перечисленные лаборатории работают с прокариотами низкой и средней степени вирулентности (опасности для человека). Опасные бактерии можно исследовать только в специализированных лабораториях.

Основу лаборатории составляют:

• термостат для регулировки и поддержания стабильных температурных режимов;
• микроанаэростат для поддержания анаэробной среды;
• холодильник для хранения сред, проб и микроорганизмов;
• центрифуги для осаждения исследуемого материала со стенок пробирок;
• печь Пастера для воздушной стерилизации лабораторных приборов;
• автоклав для стерилизации под давлением.

Кроме перечисленных аппаратов, лаборатория также оснащена микроскопами, планшетами, дозирующими приборами, наконечниками и бактериологическими анализаторами в зависимости от специфики лаборатории.

Методы выявления некоторых бактерий

Сальмонелла – патогенный бактериологический агент, который может инфицировать человека через пищу. Для своевременного изолирования зараженных продуктов и их утилизации разработан и утвержден ГОСТом в 1998 году метод выявления бактерий рода Salmonella в пищевых продуктах.

Суть метода состоит в следующем:

1. Пробу продукта высевают на неселективную питательную среду (питательный бульон, на котором может расти большинство микроорганизмов).
2. Посев выдерживается при стабильной температуре (инкубирование).
3. Производят подбор селективной среды (той, на которой растут только сальмонеллы).
4. Выполняют пересадку выросших бактериальных колоний на селективную для сальмонелл среду.
5. Регистрируют результаты.

Бактерия Сальмонелла (Salmonella)

Методология определяет все нюансы проведения исследования: от количества проб до состава питательных сред и посуды, которая может использоваться работниками лаборатории для получения достоверных результатов их работы.

Listeria monocytogenes – возбудитель бактериальной инфекции листериоза

При поражении человеческого организма Listeria monocytogenes становятся внутриклеточными паразитами (бактериальные клетки проникают внутрь эукариотических). Через некоторое время их обнаруживают в клетках практически всех внутренних органов человека, поскольку эти бактерии распространяются через кровь.

По этой причине симптомы бактериального заражения могут проявляться в разной форме: ангина, менингит, конъюнктивит и т.д., любые формы сепсиса (заражения внутренних органов).

Для предотвращения этой бактериальной угрозы разработаны и утверждены методы выявления Listeria monocytogenes в пищевых продуктах.

Для целей выявления Listeria monocytogenes нормативные акты определяют их как грамположительные неспорообразующие бактериальные палочки, которые растут на плотных селективных средах. Формы их колоний – короткие цепочки, иногда длинные нити.

Listeria monocytogenes

Технология метода:

1. Для исследования отбирается проба, которая рассеивается на питательной среде, подходящей для большого количества микроорганизмов, и инкубируется в течение суток при температуре 30°С.
2. В связи с тем, что чаще всего Listeria monocytogenes находится в продукте в небольшом количестве, на следующем этапе их выявления имеющуюся среду обогащают специально подобранными для Listeria monocytogenes питательными элементами (делают питательную среду более селективной) и выдерживают в течение 2-х суток при температуре 37°С.
3. Полученные колонии пересевают на две питательные среды: по Оттавиани и Агости (ALOA) и одну из трех (Оксфорд агар, Палкам агар, ПАЛ – питательный агар для выделения листерий). Первый посев инкубируют сутки при температуре 37°С, после чего регистрируют наличие или отсутствие колоний, характерных для Listeria monocytogenes. Второй посев выдерживают чуть дольше (на 3 часа) и также регистрируют возможные проявления колоний Listeria monocytogenes.

Возможные проявления наличия бактериальных колоний Listeria monocytogenes выглядят следующим образом:

1. Колонии клеток имеют сине-зеленую окраску. Кроме того, вокруг колонии наблюдается непрозрачный ореол.
2. Поврежденные бактериальные клетки не дают характерного ореола или он только едва заметен.
3. На ПАЛ-агаре колонии имеют серо-зеленый или оливково-зеленый цвет. Их окружает ореол черного цвета. Иногда колония имеет черный центр.

После выявления колоний Listeria monocytogenes их начинают изучать более подробно:

• производят реакцию на каталазу;
• окрашивают по Граму;
• определяют подвижность;
• проверяют на бета-гемолитическую активность и т.д.

Также сегодня в лабораториях есть материал для проведения экспресс-анализов по специализированным таблицам, которые изготавливаются под каждый вид продуктов либо другого исследуемого материала. Их можно приобрести в специализированных магазинах, как и другое лабораторное оборудование.

Выявление отдельных клеточных структур

Выявление жгутиков позволяет идентифицировать бактериальные клетки по типу подвижности.

Обнаружить клеточную структуру не так просто, как найти саму бактерию. Для этих целей используются разные способы окраски жгутиков.

Способ окраски жгутиков заключается в том, что разные по составу красители оседают на их поверхности. В результате такого оседания жгутики утолщаются. Кроме того, уменьшается прозрачность как всей клетки, так и самого жгутика (бактериальная клетка в обычных условиях практически прозрачная).

Метод окраски жгутиков по Цилю предполагает следующую технологию выполнения:

1. Каплю водного раствора с чистой культурой наносят на предметное стекло и высушивают в естественных условиях.
2. Бактерий протравливают специальным раствором на основе спирта, сернокислого железа и танина, поскольку пока бактерии живы, окрасить их жгутики невозможно.
3. После этого их прокрашивают карболовым фуксином Циля.
4. Предметное стекло промывают водой и просушивают.

После всех проведенных процедур жгутики будут видны в микроскоп как тоненькие ниточки.

Обнаружение капсул

Капсула также является клеточной структурой, которая присуща не всем бактериям и по которой прокариота можно идентифицировать.

Методы выявления капсул также основаны на окрашивании органическими анилиновыми красителями.

Окраска капсулы по Романовскому-Гимзе происходит по следующей технологии:

1. На предметное стекло наносится мазок разведенной чистой культуры.
2. Стекло устанавливается мазком вниз в чашку Петри на стеклянные подставки.
3. В чашку Петри добавляют 20 капель краски Романовского-Гимзе.
4. Через 15-20 минут предметное стекло промывают и высушивают.
5. В результате бактерии окрашиваются в темно-синий цвет, а капсулы приобретают розовую окраску.

Окраска по Михину – выявление капсул при помощи метиленовой сини Леффера. При этой окраске капсулы также приобретают розовый цвет, а бактерии – синий.

Особенности окраски капсул связаны с их составом. Капсула состоит из полисахаридов или полипептидов (капсула сибирской язвы), которые быстро вступают в реакцию с теми красителями, которые используются в лабораториях.

Окраска спор

Определенные сложности связаны с выявлением таких кислотоустойчивых структур бактерий, как споры.

Споры не окрашиваются теми простыми красителями, которые используются для более восприимчивых клеточных структур. При использовании этих способов споры остаются бесцветными.

Однако выявление спор является важным моментом, поскольку спороносные бактерии чаще всего обладают высокой патогенностью. Кроме того, ввиду повышенной кислотоустойчивости, тепло- и светоустойчивости, споры очень сложно ликвидировать.

Для выявления спор были разработаны специальные протравы, которые разрыхляют кислотоустойчивую оболочку, что позволяет красителю проникнуть внутрь.

Окрашивание спор по методу Меллера:

• мазок помещают на две минуты в хлороформ;
• обрабатывают 5% водным раствором хромовой кислоты;
• промывают в воде и окрашивают карболовым фуксином.
• споры окрашиваются в красный цвет.

Есть еще несколько методов выявления таких клеточных структур, как споры, и все они предполагают первоначальное воздействие на устойчивую стенку споры.

Выявление клеточной стенки

Клеточная стенка бактерии – уникальная структура. Только у прокариотов есть клеточные стенки, и именно благодаря этим стенкам можно производить первичную идентификацию безъядерных организмов.

Стенка прокариотической клетки состоит из белка муреина. Исходя из того, что стенки бывают однослойные и многослойные, датский врач Грам предложил способ выявления сильных патогенов по окрашиванию их стенки. Способ предполагает, что многослойные стенки не отреагируют на окрашивание и останутся бесцветными (грамотрицательные), а однослойные стенки приобретут синюю окраску.

Роль цитоплазматической мембраны и ее образований

Цитоплазматическая мембрана – важная часть клетки, которая обеспечивает связь между цитоплазмой и клеточной стенкой.

Выявить цитоплазматическую мембрану окрашиванием не представляется возможным. Кроме того, в этом нет никакой практической необходимости, поскольку цитоплазматическая мембрана – обязательная структура каждой бактериальной клетки.

Цитоплазматическая мембрана имеет практически всегда один и тот же биохимический состав. Для изучения структур клетки и ее включений необходимо изучение проводящих функций цитоплазматической мембраны. Эти исследования осуществляются такими бактериологическими методами, как молекулярно-генетический и серологический.

Юлия Пятирублева

Работаю врачом ветеринарной медицины. Увлекаюсь бальными танцами, спортом и йогой. В приоритет ставлю личностное развитие и освоение духовных практик. Любимые темы: ветеринария, биология, строительство, ремонт, путешествия. Табу: юриспруденция, политика, IT-технологии и компьютерные игры.