Как различить бактерии: грамотрицательные или грамположительные

В 1884 году датчанин по имени Ганс Кристиан Йоахим Грам провел эксперимент, ставший революционным для микробиологии. Он разработал способ, позволяющий разделить все бактерии на грамотрицательные и грамположительные. Иначе говоря, выявить при помощи окрашивания микроорганизмы, способные длительно сопротивляться воздействию антибиотиков (Грам (-)) и наоборот, восприимчивые к их воздействию (Грам (+)), независимо от их формы – шаровидные или палочки.

На полученные различия бактерий влияет строение их оболочки. Чем клеточная стенка сложнее, тем пигменту труднее в нее проникнуть и закрепиться. В итоге метод был назван в честь врача и открыл перед учеными новые перспективы, позволил проводить более оперативное и маневренное лечение пациентов, а также в значительной степени облегчил разработку новых медицинских препаратов.

Суть метода

В микробиологии этот метод приравнивается к сложным. На бактерии действуют основным и дополнительным красителями, а также обесцвечивающим веществом. Наглядно весь процесс окрашивания можно представить следующими шагами:

1. Предметное стекло очищают от жира и покрывают тонким слоем собранного мазка, после чего высушивают его естественным путем.
2. Фиксируют физическим или химическим способом, вызывая коагуляцию белков.
3. Через фильтр-бумагу наносят первый краситель и оставляют в покое на пару минут.
4. После чего убирают пигмент, добавляют на стекло раствор Люголя и выдерживают одну минуту.
5. Удаляют йодистый раствор, а бактерии промывают этиловым спиртом до обесцвечивания.
6. Ополаскивают стекло дистиллированной водой около минуты.
7. Наносят на стекло второй краситель и оставляют его не более чем на 5 минут.
8. Снова ополаскивают и высушивают фильтр-бумагой.

Реакция микроорганизмов на окрашивание

Основным красителем выступает метиловый фиолетовый или другой пигмент из трифенилметановой группы. Одной из характеристик грамположительных бактерий служит их способность создавать с этим веществом связь, которая усиливается при воздействии йода и не разрушается ацетоном или спиртом. Это делает невозможным их повторное окрашивание при дополнительном использовании сафранина или фуксина.

Благодаря различиям в биохимии клеточных стенок, грамположительные бактерии хорошо прокрашиваются в фиолетовый или насыщенный синий цвет. Их оболочки лишены дополнительного липопротеидного слоя, противостоящего неблагоприятным условиям. А потому эти бактерии являются подверженными воздействию бактериостатиков и антисептиков.

Грамотрицательные бактерии же, наоборот, почти не образуют соединений с первым красителем, даже в присутствии йода. Все возникшие связи легко разрушаются спиртом, в результате чего происходит их полное обесцвечивание в мазке. Именно на их обнаружение направлено использование дополнительного красителя.

Под его воздействием у грамотрицательных бактерий появляются красный, розовый или малиновый цвет. При этом погибшие микроорганизмы окрашиваются ярко и целиком, а живые лишь частично и довольно бледно. Их оболочка служит прочной защитой не только от пигментных веществ или антибиотиков, но и от желудочного сока, слюны и других ферментосодержащих организменных жидкостей.

Биологический материал для исследования

Для лабораторной диагностики инфекционного заболевания пациент должен сдать один или несколько из нижеописанных анализов:

1. Мазок мокроты для микроскопии. Забор производится ватными палочками или тампонами из носоглотки и не требует специальной подготовки.
2. Анализ кала. Его расшифровка позволяет выявить след токсинов, которые вырабатывают грамположительные бактерии.
3. Мазок из влагалища. Назначают для подсчета соотношения положительных и отрицательных микробов при вагинитах. Гигиенической подготовки не нужно.
4. Пункции различных жидкостей: перинатальной, синовиальной, плевральной. Назначают в исключительных случаях и проводят только по указанию врача.

Грам (+) и Грам (-) представители и их воздействие на организм

Итак, клеточная стенка грамположительных бактерий имеет лишь один слой. Единственное исключение, известное в современной микробиологии, – Deinococcus-Thermus. Несмотря на наличие защитной мембраны, при проведении теста она хорошо окрашивается в синий цвет.

Основными представителями Грам (+) бактерий являются:

1. Кокковые или шаровидные (кроме протеобактерий Neisseria):
   • стафилококк, провоцирующий сепсис крови и гнойные высыпания на коже;
   • стрептококк, ведущий к развитию ревматизма и тонзиллитов;
2. Палочковидные:
   • фирмикуты, служащие источником сибирской язвы и токсических инфекций;
   • клостридии, как возбудители столбняка и ботулизма;
   • листерия, заражение которой приводит к воспалению мозга.
3. Булавовидные:
   • коринебактерии, вызывающие дифтерию.

Грамотрицательные бактерии, более устойчивые к антителам за счет дополнительной мембраны, представлены такими разновидностями:

1. Спиралевидные:
   • спирохеты, которые являются возбудителями лептоспироза, возвратного тифа и сифилиса;
   • спириллы, вызывающие содоку – лихорадкоподобное состояние.
2. Палочки:
   • риккетсии, чей главной характеристикой служит внутриклеточный паразитизм;
   • хламидии – без лечения могут развиться ЗППП, конъюнктивит, пневмония.

Значение для медицины

Разработанный Грамом этиологический тест оказался востребованным не только в микробиологии. Информация, полученная благодаря ему, также продвинула на новый уровень медицину, в особенности лечение пациентов, зараженных грамотрицательными бактериями. Несмотря на то, что gram-negative bacteria (грамнегативные палочки) врачи причисляют к условно-патогенной микрофлоре, ошибочно считать их безобидными. Они вызывают бурную ответную реакцию организма и обладают высокой резистентностью, что часто приводит к летальным исходам.

У больных отмечается воспаление бронхолегочной системы в тяжелой степени. Вызывает его ЛПС, или липополисахаридный слой бактерий, которого лишены грамположительные микроорганизмы. Микробиология определяет этот компонент мембраны клетки как эндотоксин для человеческого организма, независимо от формы бактерии: спириллы или палочки. Попадая внутрь, он активизирует синтез цитокинов и иммунный ответ.

В итоге начинает развиваться локализованное воспаление. С течением времени токсины поступают в кровеносное русло и далее разносятся транспортной системой по всему телу. Больной начинает испытывать все более нарастающие признаки интоксикации. Растет частота дыхания и температура тела, кровяное давление падает. Проявляется токсический шок, который в некупированном состоянии заканчивается смертью.

Благодаря открытию Грама врачи смогли найти альтернативу малоэффективным в подобных случаях пенициллину и лизоциму. Например, объединение последнего с этилендиаминтетрауксусной кислотой, или EDTA. Помогли и успешные клинические испытания ампициллина, стрептомицина, хлорамфеникола и налидиксовой кислоты в борьбе с грамотрицательными бактериями.