Сложности идентификации бактерий в современной микробиологии

Изучение микроорганизмов невозможно без распознавания принадлежности отдельных их колоний к тем или иным биологическим видам, типам, родам и т.д. Процесс аутентификации организмов является одним из самых важных и трудоемких этапов проведения биологических исследований. В бактериологии (раздел микробиологии) эта процедура носит название идентификация бактерий.

Методы проведения исследований по распознаванию микробов

Метод познания того или иного предмета представляет собой комплекс мер по решению определенной задачи. Методы идентификации различных микроорганизмов разрабатывались микробиологами и бактериологами на протяжении многих лет, и сегодня эти методы активно используются в науке, медицине, фармацевтике и даже в промышленном производстве (в том числе и продуктов питания). Основными методами распознавания бактерий являются:

• метод прямого прижизненного окрашивания различных проб воды, почв и осадков;
• прямые методы оценки метаболической активности клетки;
• метод молекулярного анализа;
• метод обратной транскрипции.

Перечисленные методы представляют собой основу для исследователей и являются базисом для большого количества методик, которые позволяют определять такие свойства бактерий, как:

• морфологические (особенности и индивидуальные свойства строения клеток);
• культуральные свойства (питание, дыхание, условия для роста бактериальной культуры);
• ферментативные (биохимические свойства, связанные со способностью бактериальной культуры расщеплять сахара, белки, разрушать эритроциты);
• антигенные (свойства, связанные с особенностями антигенов чистой бактериальной культуры).

Установление специфических свойств дает возможность исследователю составить максимально полное представление о выделенной культуре бактерий.

Стадии идентификации

Несмотря на вековую историю изучения микроорганизмов, микробиология и сегодня испытывает сложности в изучении бактерий. Причина тому – микроскопические размеры самих организмов и продуктов их жизнедеятельности. Трудности присутствуют на всех стадиях. Всего основных стадий пять:

1. Выделение чистой культуры.
2. Приготовление суспензии и инокуляция лунок.
3. Инкубационный период.
4. Фиксация результатов.
5. Выводы и интерпретация результатов.

Порядок реализации каждой стадии зависит от того, идентификация на какие бактерии должна быть выполнена исследователем (аэробные, неферментирующие, грамотрицательные и т.д.).

Выделение чистой культуры

Идентификация любых бактерий невозможна без выделения чистой культуры. Это требование в микробиологии связано с тем, что присутствие микробов других родов и семейств во время проведения бактериологических исследований всегда существенно искажает результаты, вследствие чего исследователь производит неверные заключения. Для выделения чистой культуры используются различные методы, большинство из которых основано на бактериальных чашечных посевах:

• в чашки с различными питательными средами рассевают отобранные из собранных проб образцы;
• выращенные отдельные колонии (культуры) высевают на специально подобранных средах, чтобы по продуктам жизнедеятельности колонии в питательной среде изучать биохимические реакции, протекающие внутри бактериальной клетки и вне ее.

Так, например, для выделения чистой аэробной (кислородозависимой) культуры практикуется следующая методика:

• исследователь производит механическое дробление исследуемой пробы;
• одну каплю изучаемого материала растирают по поверхности мясо-пептонного агар-агара (МПА);
• тем же шпателем (только без нового материала) производят посев еще на нескольких чашках с таким же МПА.

Полученные образцы с аэробными сообществами могут изучаться в свете идентификации на бактерии определенных родов.

Проверка по Граму

Практически при каждом бактериологическом исследовании в микробиологии бактериолог проводит проверку культуры по Граму (так называемое окрашивание по Граму). Это исследование дает возможность выявить наличие в образце грамотрицательных микроорганизмов. Грамотрицательные бактерии имеют особым образом устроенную клеточную стенку, которая состоит из нескольких белковых слоев (белок муреин). Вследствие такого устройства клеточной стенки, в грамотрицательных бактериальных клетках транспорт веществ внутрь клетки и за ее пределы имеет свои специфические черты. Это обстоятельство является важным при изучении биохимической активности грамотрицательных микроорганизмов. Без изначального определения особенностей строения клеточной стенки невозможно правильно подобрать питательную среду для дальнейшего культивирования и изучения грамотрицательных бактерий.

Идентификация по ферментативной активности

В результате изучения ферментативной активности бактерии (синтез определенных ферментов) исследователи могут давать достоверные заключения о принадлежности микроорганизмов к тем или иным биологическим родам, семействам и даже видам. Ферментативная активность исследуется по пяти основным направлениям:

1. Изучение изменения уровня кислотности питательной среды.
2. Изучение конститутивных ферментов (постоянно синтезируемых в бактериальной клетке). Этот метод позволяет идентифицировать микроорганизмы без создания специализированных условий для их роста. Так, например, производится идентификация на бактерии рода Bacillus, которые требуют особых условий для культивирования, поскольку являются анаэробами (среди представителей рода Bacillus есть также аэробные виды).
3. Использование меченых источников углерода.
4. Исследование конечных продуктов жизнедеятельности (метаболизма) бактерий в питательной среде.
5. Идентификация на бактерии по визуальному выявлению признаков роста колонии (степень помутнения).

Интерпретация результатов проведенных исследований и тестов производится с соблюдением следующих трех принципов:

1. Должно быть выявлено и изучено максимальное количество признаков.
2. Ни один из признаков не является заведомо более весомым.
3. Идентификация результируется как коэффициент соответствия признаков выделенной исследователем культуры свойствам эталонного штамма.

Эталонные штаммы чаще всего представлены на планшетах тест-систем, которые позволяют завершить идентификацию бактерий определенного рода по исследованным биохимическим признакам.

Идентификация неферментирующих аэробных грамотрицательных микроорганизмов

Для родов бактерий этого типа (НГОБ) разработаны специализированные тест-системы, позволяющие определить принадлежность микроорганизмов к определенным группам. Определяется присутствие НГОБ по биохимическому составу питательных сред, на которых выращивались исследуемые бактериальные колонии. Особенность неферментирующих микробов состоит в том, что они не разлагают молекулы глюкозы, а используют ее в качестве окислителя (гликолиз). К основным родам неферментирующих бактерий относятся аэробные Pseudomonas, аэробные Acinetobacter, аэробные Burkholderia, аэробные Stenotrophomonas. Идентификация на НГОБ позволяет определить наличие патогенных микроорганизмов в собранных образцах и вовремя предпринять меры по предотвращению распространения инфекции.

Серологическая идентификация

Этот вид распознавания микроорганизмов применяется для идентификации антигенов бактериальной культуры. Серологические исследования проводятся с использованием иммунной диагностической сыворотки, по которой изучаются иммунные реакции исследуемых микроорганизмов:

• агглютинации;
• преципитации;
• нейтрализации;
• с использованием меченых антител.

Реакция агглютинации заключается в констатации выпадения осадка (агглютината), который появляется в результате взаимодействия бактериальной клетки с определенными антителами. Серологическая реакция преципитации заключается в выявлении антигенов, вырабатываемых определенными микробами на антитела, с образованием характерного мелкозернистого осадка.

Опасность неидентифицированного многообразия

Колоссальное количество неидентифицированных микроорганизмов, которые постоянно окружают человека в быту, может нести потенциальную угрозу для здоровья и даже для жизни. Так, микробиологами было исследовано наличие представителей рода спорообразующих бактерий Bacillus в колбасных и мясных продуктах, которые реализуются с полок магазинов. Как выяснилось, патогенные Bacillus присутствуют во всех видах колбас и в обработанных мясных продуктах:

1. В сырокопченых колбасах содержится более миллиарда представителей рода Bacillus на 1 г продукта.
2. В фарше также присутствует восьмизначное количество Bacillus, возбудителя сибирской язвы.
3. В сосисках и вареных колбасах Bacillus представлен только тысячей КОЕ на 1 г продукта.
4. Более всего представителей рода Bacillus было обнаружено в ферментированных колбасах. Исследователи отмечают не только многочисленность бактерий рода Bacillus в этих продуктах, но и видовое разнообразие.

При этом не стоит упускать из виду, что спорообразующие аэробные Bacillus при возникновении благоприятных условий для роста и размножения являются самыми опасными возбудителями инфекционных заболеваний, а при неблагоприятных – образуют термоустойчивые споры и готовы ждать своего часа сколь угодно долго.  

Юлия Пятирублева

Работаю врачом ветеринарной медицины. Увлекаюсь бальными танцами, спортом и йогой. В приоритет ставлю личностное развитие и освоение духовных практик. Любимые темы: ветеринария, биология, строительство, ремонт, путешествия. Табу: юриспруденция, политика, IT-технологии и компьютерные игры.