Микроорганизмы в своем нативном состоянии не видны не только в оптические, но и в электронные микроскопы. Причиной подобного явления является их прозрачность – ткани микроорганизма имеют коэффициент преломления света подобный стеклу.
Для изучения прокариотов под микроскопом используются различные методы окрашивания, что дает возможность придать цвет бактериям или их частям. Кроме того, микробы обладают тинкториальными свойствами – важной особенностью, состоящей в неодинаковом взаимодействии различных тканей прокариота с красителем.
Окрашивание бактерий
Способов придать цвет микроорганизмам много.
В зависимости от предмета окрашивания используемые для этого методики подразделяют на:
- позитивные способы, окрашивающие ткани микроорганизмов;
- негативные методы – окрашивающие пространство вокруг бактерии, в результате чего она становится видна как силуэт на окрашенном фоне.
Как позитивное окрашивание, так и негативное делятся в зависимости от состояния микроорганизма на:
- витальное (прижизненное) окрашивание – чаще всего применяются слабые растворы метиленового синего, конго красного и толуоидинового синего;
- поствитальное (фиксированное) окрашивание.
Окрашивание фиксированных образцов наиболее эффективный способ придания бактерии цвета. В зависимости от необходимого результата применяют простые или сложные методы окрашивания.
Простое окрашивание
Так, простые методы поствитального окрашивания бактерии позволяют получить информацию о том, какого размера и формы микроорганизм, установить локализацию и взаимное расположение отдельных прокариотов.
Для придания цвета бактериям обычно используют растворы щелочного метиленового синего или фуксина Пфейфера. Методологически способ несложен: раствор красителя наносится на фиксированный препарат и выдерживается, согласно методике, от 1 до 5 минут, после чего окрашенный образец промывают (водой) и сушат. Препарат готов, и можно проводить микроскопические исследования.
Комбинированные (сложные) методы окрашивания
При более глубоких исследованиях применяются сложные способы окрашивания фиксированных образцов. Сложные методы придания цвета микроорганизмам подразумевают воздействие на исследуемый препарат несколькими окрашивающими реагентами, один из которых называют основным, а остальные – дополнительными. Также используются различные обесцвечивающие агенты:
- кислоты (серная, соляная в различных разбавлениях);
- спирты (в основном этиловый);
- ацетон и другие.
Сложные методы окраски позволяют выявить структуру микроорганизма, иные свойства и особенности бактерии.
Наиболее распространенными методами придания цвета фиксированным препаратам являются следующие:
- метод Грама;
- методика Циля-Нельсона;
- метод Пешкова;
- окрашивание по Романовскому-Гимзе.
Окраска по Граму
Методика окрашивания бактерий, предложенная в 1884 году Г. Грамом, получила широкое распространение и имеет большое значение для систематики микроорганизмов и диагностики инфекционных болезней.
Метод Грама основан на биохимических свойствах клеточной стенки прокариотов; он позволяет разделить все микроорганизмы на 2 группы:
- грамположительные – в результате окрашивания приобретают устойчивый синий цвет;
- грамотрицательные – обесцвечиваются при промывании, после контрастного окрашивания красителем красного цвета приобретают цвет от красного до розового.
При окрашивании по Граму используют анилиновые красители – метиловый фиолетовый и генциановый – с последующей фиксацией красителя йодом. Окрашенный образец промывают спиртом, после чего получают 2 группы:
- микроорганизмы, окрашенные в синий цвет, – грамположительные;
- обесцвеченные бактерии – грамотрицательные.
Обесцвеченные грамотрицательные микроорганизмы обрабатывают красным красителем (сафранин или фуксин), окрашивающим их в цветовом интервале красный – розовый.
Было установлено, что окраска выявляет наличие у грамотрицательных микроорганизмов внешней мембраны, не позволяющей красителю проникнуть в клетку.
К грамположительным бактериям относятся почти все кокки и спорообразующие бациллы, а к грамотрицательным – большая часть неспороносных микробов.
Окраска по Цилю-Нельсену
Данная методика поствитального окрашивания, предложенная немецкими медиками Ф.Цилем и Ф.Нельсоном в1883 г., позволяет определить в пробе кислотоустойчивые бактерии, в частности возбудителей лепры, туберкулеза и микобактериоза.
Методика придания цвета микробам основана на присутствии в клетках кислотоустойчивых прокариотов оксикислот, липидов и воска, что является причиной неудовлетворительного окрашивания разведенными красителями.
При окрашивании по Цилю-Нельсону фиксированный препарат обрабатывают карболовым фуксином Циля и подогревают над горелкой до появления паров, охлаждают и повторяют процесс 3 раза. По завершении препарат промывают водой, обесцвечивают раствором серной или соляной кислот и тщательно промывают. Далее препарат в течение 1 минуты обрабатывают раствором метиленового синего, промывают водой и высушивают.
В результате цвет кислотоустойчивых микроорганизмов – интенсивно красный, на фоне остальной микрофлоры, имеющей светло-синюю окраску.
При необходимости дифференцировать бактерии лепры от возбудителя туберкулеза применяется метод Семеновича-Марциновского:
- бактерии лепры окрашиваются в голубой цвет;
- возбудители туберкулеза – бесцветные.
Метод Пешкова
Окраска по Пешкову проводится для выявления эндоспор грамположительных бактерий. Используют жидкость Карнуа, метиленовый синий, фуксин по Пфейферу (или нейтральный красный).
Результат окрашивания по Пешкову прекрасно микроскопируется:
- зрелые эндоспоры становятся голубыми;
- молодые эндоспоры – насыщенно-синие;
- цитоплазма приобретает красный цвет;
- хроматин – зерна приобретают фиолетовую окраску.
Окраска микроорганизмов по Романовскому-Гимзе
Метод обеспечивает окрашивание ацидофильных бактерий в разные оттенки красного, а базофильных – в цветовой гамме от пурпура до синего. Методика имеет большое практическое значение при определении паразитов крови (спирохета) – цитоплазма микроорганизмов окрашивается в голубой цвет, а клетки, содержащие ядра, – в красно-фиолетовый.
Окраска по Леффлеру
Метод окраски по Леффлеру позволяет получить зримую картину жгутиков бактерий путем последовательного применения танина и красителя. Также наличие жгутиков может выявить окраска по Морозову:
- обрабатывают препарат кислотой, при этом жгутики и оболочки разрыхляются;
- протравливают танином;
- окрашивают азотнокислым серебром – жгутики и оболочка покрываются толстым слоем препарата и приобретают цвет в гамме от желтого до насыщенно-коричневого.
Кроме того, Леффлер разработал методику окраски дифтерийных бактерий метиленовым синим Леффлера (готовят из спиртового раствора метиленового синего, слабого раствора щелочи и дистиллированной воды). В результате обработки бактериальная палочка приобретает голубой цвет, а гранулы волютина дифтерийных бактерий окрашиваются в темно-синий.
Помимо жгутиков, методики окраски бактерий позволяют определить наличие капсул, для чего применяется методика Бурри-Гинса: последовательная обработка препарата разведенной тушью, спиртом, фуксином Пфейфера. После чего образец промывается водой и высушивается.
Капсулы выглядят как светлые ореолы, расположенные вокруг красных бактерий на темном фоне.
Естественная окраска колоний микроорганизмов
Существует целая группа микроорганизмов, называемая хромогенными бактериями, колонии которых как в природе, так и на искусственных средах окрашены ярко и разнообразно. Цветовая гамма представлена от нежно-лимонного до густого темно-синего и даже черного. Хромогенных бактерий множество – это и кокки, и палочки, и спириллы. Химический состав красителей тоже очень разнообразен.
Независимо от цвета колонии все хромогенные бактерии совершенно бесцветны, окраску обеспечивают капельки, кристаллики или зернышки, расположенные вне клеток и являющиеся отходами жизнедеятельности бактерий. Эти отходы могут растворяться и диффундировать в окружающую среду, что приводит к окрашиванию пространства колонии.
Понятие «хромогенные бактерии» появилось в 1872 году благодаря Ф. Кону. Было выявлено, что бактерии, обладающие способностью к хромогенезу, не являются естественной, а лишь сборной группой, которую объединяет только способность окрашивать среду.
Неоднократно были предприняты попытки классификации хромогенных бактерий, однако успешных предложено не было.
Сегодня применяется классификация, основанная на растворимости пигмента:
- пигмент водорастворим;
- пигмент не растворяется в воде, но растворяется в спирте;
- нерастворимый ни в воде, ни в спирте пигмент.
Данная классификация несовершенна, что объясняется недостатком информации как по природе пигмента, так и по самой функции хромогенеза.
Хромогенных бактерий известно уже очень много, а сортов красителей, которые они производят, намного меньше. Это объясняется тем, что различные хромогенные бактерии производят один и тот же пигмент.
Все бактериальные пигменты делят на 3 большие группы:
- липохромы;
- продигиозин;
- бактериофлуоресцин.
Липохромы
Колонии, выделяющие липохромы, окрашены в цвета от желтого до красного. К ним относятся почти все кокки и в меньшей степени палочки.
Физико-химические свойства пигмента:
- агрегатная форма – кристаллики;
- нерастворим в воде;
- растворим в органических растворителях (спирт, бензин, эфир, сероуглерод и др.);
- омыляется горячей щелочью;
- с концентрированной серной кислотой дает синее окрашивание – липоциановая реакция Цопфа.
Продигиозин
Бактерии, выделяющие красный пигмент продигиозин, известны с давних времен как бактерии «чудесной крови».
О них упоминал Пифагор, запрещая своим ученикам есть вареные бобы, которые простояли ночь – на них могла появиться «кровь». В Средние века замечали появление «чудесной крови» на продуктах, когда сначала появляются небольшие кровавые капельки, которые очень быстро растут и прямо заливают продукты кровавым слоем.
Появление «чудесной крови» отмечалось на богатых крахмалом продуктах – хлебе, рисе, поленте, вареном картофеле, бывает на мясе или отварных яйцах, но достаточно редко. Может развиться на молоке, тогда слой сливок окрашивается в красный цвет, а само молоко быстро створаживается.
Бактерии «чудесной крови» не являются патогенными, однако некоторые продукты их жизнедеятельности – токсальбумины – обладают токсическими свойствами.
Физико-химические свойства пигмента:
- жидкость;
- малорастворим в воде;
- растворяется в органических растворителях (спирты, эфир, хлороформ, сероуглерод и другие);
- при взаимодействии со щелочами образуется оранжево-желтая краска;
- при воздействии кислот образуется карминовая и далее – фиолетовая краска;
- солнечный цвет разрушает пигмент в растворах.
Бактериофлуоресцин
Флуоресцирующий пигмент вырабатывают маленькие бактерии-палочки, подвижные за счет жгутика на одном конце, все они не образуют спор.
Большая часть бактерий является сапрофитами и имеет широкий ареал обитания. Колонии обнаруживают зелено-травяную флуоресценцию.
Физико-химические свойства пигмента:
- в чистом виде не выделен, предположительно является белковым веществом;
- водорастворим;
- не растворяется в спиртах, эфирах и бензине;
- концентрированный раствор имеет бледно-желтый цвет и флуоресцирует голубым цветом;
- обработка щелочью сдвигает флуоресценцию в зеленый цвет;
- при добавлении кислоты флуоресценция прекращается.
Кроме трех основных пигментов, были выделены пиоцианин (синий), пиоксантин (красно-бурый), синцианеин (синий) и другие.
Одни бактерии образуют пигмент всегда, другие микроорганизмы выделяют пигмент иногда. Есть бактерии, которые всегда выделяют только один пигмент, а есть бактерии, выделяющие несколько различных пигментов.
Хромобактерии изучены недостаточно хорошо, не выявлены причины, от которых зависит потеря хромобактериями способности выделять пигмент. Такие колонии называют лейкорасой. Однако при дальнейших посевах лейкораса может дать нормальное окрашивающее потомство.
Изучение способности бактерий к хромогенезу представляет большое не только научное, но и практическое значение.
Образование высшее филологическое. В копирайтинге с 2012 г., также занимаюсь редактированием/размещением статей. Увлечения — психология и кулинария.
Загрузка...
